style="width:11.9534in;height:4.24666in" />变性 本文是学习GB-T 34265-2017 Sanger法测序技术指南. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了 Sanger
测序方法的术语和定义、缩略语、原理、主要仪器、设备、Sanger 法基因测序
指标、Sanger 法基因测序方法、Sanger 法基因测序的应用。
本标准适用于对动物组织、植物组织、血液、口腔黏膜、毛发、粪便、土壤、微生物等生物样品中的
DNA 通过 Sanger 测序方法进行测序。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
基因测序 gene sequencing
对核酸分子的核苷酸排列顺序的测定，即测定组成核酸分子的腺嘌呤(A)、
鸟嘌呤(G)、 胞嘧啶(C)
和胸腺嘧啶(T) 或者是尿嘧啶(U) 的排列顺序。
[GB/T 30989—2014,定义3.18]
3.2
Sanger 测序方法 method of Sanger sequencing
用于基因测序的双脱氧链末端终止法，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以
A、T、C、G
结束的四组不同长度的核苷酸链，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。
3.3
变 性 denaturation
蛋白质或核酸的二级或三级结构在物理或化学因素作用下被改变而导致其理化性质改变和生物活
性丧失的现象。
3.4
引物 primer
在DNA
复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长
度和顺序的寡核苷酸链。
[GB/T 30989—2014,定义3.11]
3.5
测序读长 read length of gene sequencing
测序能测得的最长基因片段的长度。
注：通常以碱基数表示。
GB/T 34265—2017
[GB/T 30989—2014,定义3.24]
3.6
QV 值 quality value
用于表示测序结果准确质量的数值。
注：QV10 代表90%的准确度，QV20 代表99%的准确度，QV30
代表99.9%的准确度，QV40 代表99.99%的准确 度，QV50
代表99.999%的准确度。
3.7
不可信区域 unreliable area
测序结果序列两端 QV 值低而不作为结果分析的区域。
下列缩略语适用于本文件。
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
ddNTP: 双脱氧核糖核苷三磷酸(double deoxy-ribonucleoside triphosphate)
dNTP: 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
NaAc: 醋酸钠(sodium acetate)
PCR: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
RNA: 核糖核酸(ribonucleic acid)
在DNA 分子结构中，碱基之间的氢键具有固定的数目，且 DNA
两条链之间的距离保持不变。
DNA 分子结构中的4种碱基之间的配对遵循一定的规律，即A 仅与T 配对，G 仅与C
配对，反之亦然。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间有两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间有三个氢键，即
A=T,G=C。 根据碱基互补
配对的原则， 一条链上的 A 的数量等于互补链上的 T 的数量； 一条链上的 G
的数量等于互补链上的C
的数量，反之亦然
每一轮序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种 dNTP,
并混入少量一种 ddNTP。 由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3'-OH 基团，在DNA
合成反应中不能形成磷酸二酯键，用来 中断 DNA
合成反应，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或 C 处终止。在4个DNA
合成反应体 系中分别加入一定比例的带有荧光同位素标记的某种 ddNTP,
通过凝胶电泳和放射自显影，就可以根
据电泳带的位置确定待测分子的 DNA 序列。 Sanger法测序原理示意图参见附录
A。
6.1 电子天平，相关指标宜参照GB/T 26497—2011。
6.2 电泳装置，相关指标宜参照YY/T 0087—2004。
6.4 离心机，相关指标宜参照 YY/T 0657—2008。
GB/T 34265—2017
6.5 用于溶解电泳胶时进行加热的加热装置，最高温度可达到60℃。
6.6 用于测定核酸浓度的设备，如分光光度计、核酸定量分析仪。
6.7 PCR 仪，相关指标宜参照YY/T1173—2010。
质粒浓度宜大于或等于50
ng/μL,体积宜大于或等于10μL,反应数增加时，所需的体积数宜相应
增加；质粒样品宜溶于一级水， 一级水应符合GB/T 6682
的要求；质粒纯化后的 OD260 nm/OD280 nm
值宜在1.6至2.0之间；推荐明确载体及预期插入目的片段的长度。
纯化PCR 产物在电泳检测中条带单一，并与目的片段大小一致；纯化 PCR
产物宜溶于一级水，纯
化 PCR 产物的 OD260 nm/OD280nm值宜在1.6至2.0之间；PCR 产物片段小于150
bp 时，建议对其
进行克隆后再测序。
未纯化 PCR 产物在电泳检测中可分辨出目的条带；PCR
产物片段宜大于或等于200 bp,若产物片
段小于150 bp 时，建议对其进行克隆后再测序。
测序引物宜在17 bp 至25 bp 之间，测序引物的 Tm
值宜在55℃至65℃之间；测序引物与待测样
品之间宜仅有一个结合位点；测序引物建议避免形成引物二聚体、发卡结构或复杂二级结构；随机引物、
兼并引物和混合引物不宜作为测序引物。
纯化后PCR 产物模板用量：
a) 产物片段长度为100 bp～200 bp时，用量宜为1 ng～3ng;
b) 产物片段长度为200 bp～500 bp时，用量宜为3 ng～10ng;
c) 产物片段长度为500 bp～1000 bp时，用量宜为5 ng～20 ng;
d) 产物片段长度为1000 bp～2000 bp时，用量宜为10 ng～40ng;
e) 产物片段长度大于2000 bp 时，用量宜为20 ng～50 ng。
其他模板用量，质粒用量宜为100 ng～300 ng;大分子量模板(如 Cosmid、BAC)
宜大于或等于
0.5μg;细菌基因组 DNA 宜大于或等于2μg。
按基因测序仪厂家说明书要求的配比配制反应体系。相关试剂及溶液的配制参见附录B。
标记物宜采用 HEX、JOE、ROX、TET、TAMRA、FAM、LIZ、VIC、NED 或 PET,
标记物激发波长
GB/T 34265—2017
宜为535 nm、520 nm、588 nm、521 nm、560 nm、494 nm、638 nm、538 nm、546
nm、558 nm。
当待测核酸片段长度超过所使用仪器有效读长时，测序读长宜达到所使用仪器的有效读长；当待测
核酸片段序列长度小于所使用仪器的有效读长时，测序读长宜包括待测核酸片段序列全长。
可信区域的QV 值建议达到QV20,QV=-10×lgPe,Pe 代表碱基读取的错误率，QV20
表示99%
准确率。
首先利用测序样品通过测序PCR
反应获得待测序产物，然后对待测序产物进行纯化与变性后，将
变性产物上样至基因测序仪中电泳，获得电泳图谱，经基因测序仪配套的数据分析系统对图谱进行分析
后，获得所测序列信息，并形成碱基序列输出。
按拟采用的 Sanger
基因测序仪的配套试剂要求的配比配制。测序反应体系的配制可参照附录 C
进行。
根据待测样品的大小及测序引物 Tm
值，调整扩增程序，扩增程序中的退火温度宜在50℃~
55℃。扩增程序参见附录D。
宜采用乙醇/EDTA/NaAc
法对待测序产物进行纯化，让残余乙醇挥发干，每个样品加入10 μL 甲
酰胺。乙醇/EDTA/NaAc 法参见附录 E。
安装毛细管并对其位置进行校正，然后通过人工手动或者由仪器自动对毛细管进行灌胶。
毛细管和电极伸入样品溶液中，加上电压使得待测序产物中带负电的 DNA
分子进入毛细管，并在
电场的作用下向阳极泳动。
待测序产物中带有荧光标记的DNA
片段按大小依次通过激光检测区，受激发出荧光，产生荧光信
GB/T 34265—2017
号并被荧光信号收集器收集，收集到的荧光信号将通过配套处理软件转换成电泳图谱。
通过配套的数据分析系统对图谱数据进行序列分析，得出所测基因序列信息，形成碱基序列输出。
Sanger 法测序技术可以应用在多个方面：DNA
测序中的再测序，种属鉴定，基因型分析和基因突
变检测，农牧业育种，遗传病诊断，药物疗效和个体化差异的筛查，产前诊断，亲子鉴定。
GB/T 34265—2017
(资料性附录)
Sanger 法测序原理示意图
Sanger 法测序原理如图 A.1 所示。
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(Degeneration)
退火
(Annealing)
延仲
(Extension)
产物
(Products)
A
图 A.1 Sanger 法测序原理示意图
GB/T 34265—2017
(资料性附录)
试剂及溶液配制
B.1 乙醇醋酸钠混合物的配制
将 5 0 mL 无水乙醇与2 mL 的 NaAc(3 mol/L,pH5.2)、10mL一级水混匀即可。
B.2 75% 乙醇
将75 mL 的无水乙醇加25 mL 的一级水混匀，存于-20℃。
B.3 引物配制
根据所需引物量，按下述配比进行稀释。
10μL10 mol/μL 的引物加21.25μL 的一级水，混匀即得3.2μmol/μL 的引物。
GB/T 34265—2017
(资料性附录)
测序反应体系的配制
C.1 相关试剂配制
2.5×BigDye V3.1 Mix 的配制：将 BigDye V3.1
Mix原管(10×)解冻低速短暂离心，原液分装 25μL到1.5 mL 的 Ep
管中备用；然后在需使用的 Ep 管中，加入75μL 的一级水，震荡混匀即可得到
2.5×的 BigDye V3.1 Mix。
C.2 测序反应体系配制
测序反应体系配制参照表 C.1 进行。
表 C.1 测序反应体系配制表
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3.2 μmol/μL |
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GB/T 34265—2017
(资料性附录)
扩增程序
根据待测样品的大小，以所选用基因测序仪的有效读长为分界点，分别选择相应的扩增程序进行扩
增，程序如下：
a) 一般测序
96℃ 10 s,50℃ 5s,60℃4 min;重复25个循环；
b) 大分子测序
96℃ 30 s,50℃~55℃ 10s,60℃ 4min;重复50个循环；
注：根据待测样品的实际大小、测序引物的 Tm
值，上述扩增程序中的延伸时间、退火温度可进行相应的调整。
GB/T 34265—2017
(资料性附录)
待测序产物纯化
待测序产物的纯化一般采用乙醇/EDTA/NaAc 法纯化，步骤如下：
a) 将测序 PCR 产物短时离心，从而将待测序产物转移至96孔板底部；
b) 加乙醇醋酸钠混合物31μL/反应，涡旋混匀4次以上，避光静置15 min;
c) 4℃、4000 r/min 离心30 min,马上倒置96孔板，短时离心至转速达900
r/min(约140g) 时 终止离心；
d) 每反应加100μL75% 乙醇，4℃、4000 r/min 离心5
min;然后马上倒置96孔板，短时离心至 转速达900 r/min(约140g)终止离心；
e) 室温放置15 min,每反应加10 μL
甲酰胺，盖好，涡旋4次以上混匀，短暂离心，室温5 min 溶解；
f)
如果不是用测序96孔板纯化，则需将样本转移至测序96孔板，盖好。并对测序96
孔板孔中 对应的样本进行记录。
注：可采用等效试剂盒进行纯化。
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